Как оптимизировать стадию минерализации?

Цели минерализации

При описании трёх стадий в методе Кьельдаля мы частично уже рассмотрели вопросы, связанные с эффективностью минерализации. Это самая долгая стадия процесса, поэтому именно её стоит оптимизировать в первую очередь. Наши цели на этой стадии:

• полностью разрушить органическую матрицу образца и перевести углерод в CO₂, водород в H₂O, а азот в определяемую форму солей аммония;
• итоговая реакционная масса должна быть гомогенной и представлять собой прозрачный раствор;
• селективно преобразовать азот, то есть аминные и амидные группы перевести в соли аммония, не окислив их при этом до молекулярного азота или других соединений, а другие формы (нитраты, нитриты, нитрогруппы) оставить как есть.

Хорошо бы этих целей достичь быстро и использовать минимум реагентов. Как этого достичь и получить правильные результаты? На что мы можем влиять?

1

2

3

Температура и катализатор

Из общих химических соображений мы знаем, что увеличение температуры на 10 °C ускоряет большинство реакций в 2–4 раза. В статье о роли катализаторов мы уже писали, что температура кипения концентрированной серной кислоты, 337 °C, не обеспечивает должной скорости протекания минерализации, а вот при добавлении к ней солей можно добиться температур значительно выше — этому и служит основной компонент таблеток, сульфат калия. Согласно накопленным исследованиям оптимальным температурным интервалом для минерализации считается 360–410 °C. Всегда нужно помнить, что за счёт потерь при теплопередаче температура нагревательного аппарата, дигестора, должна быть всегда несколько больше.

Мы рекомендуем начать с соотношения 1,5–2,0 мл кислоты на 1 г катализатора или 7,5–10 мл на стандартную таблетку 5 г. Если от образца ожидается бóльшее поглощение кислоты, например если в нём много жиров, то кислоты надо добавлять больше — 2,5–2,8 мл на 1 г. Бóльшая температура может привести к протеканию побочных окислительных процессов (в частности, окисления азота до молекулярного) и потере части этого азота, уносимого в паровой фазе; также растёт расход кислоты на естественное улетучивание из области реакции.

Добавление слишком большого количества катализатора (менее 1 мл кислоты на 1 г) может обернуться выпадением осадков из раствора после охлаждения.

Мощность нагрева

Мощность нагрева также является важным фактором при подборе режима. На первой стадии процесс идёт энергичнее всего, поэтому рекомендуем, если аппарат позволяет, установить пошаговую программу нагрева с меньшей интенсивностью в начале. Если нет, то регулировать можно вручную. Слишком сильный нагрев на первой стадии приводит к высокой разнице температур между нагревателем, колбой и реакционной массой. Это приводит к серьёзным деформациям стекла и его более быстрому износу, не говоря о вопросах безопасности. Кроме того, нагреваясь слишком быстро, жидкость в колбе может «проскочить» свою точку кипения, перейдя в перегретое состояние, а затем резко вскипеть и выбросить реакционную массу из колбы. Это, во-первых, небезопасно, а во-вторых, приведёт к кросс-контаминации соседних образцов, и придётся начинать всё сначала, потеряв образцы, реагенты и время, в том числе на мойку колб.

Увеличение или ослабление нагрева в режиме кипения не приводит к повышению или понижению температуры, а только лишь влияет на интенсивность кипения. Когда режим более-менее устоялся, уровень нагрева подбирают так, чтобы конденсация не доходила до конца колбы примерно на треть. Это позволит избежать потерь и перекрёстного загрязнения. На рисунке изображена область, в которой не должно наблюдаться капель.

Количество образца

Из общих соображений образца должно быть достаточно много, чтобы получать воспроизводимые и точные результаты, но чем меньше, тем лучше, чтобы экономить на реагентах и снизить потери самого образца, поскольку Кьельдаль — разрушающий метод.

В идеале образец должен содержать 50–120 мг азота, что соответствует от 3 до 17 мл используемого титранта на финальной стадии. Соответственно, масса образца рассчитывается, исходя из ожидаемого содержания белка. Если его концентрация менее 5 %, нужно брать около 1 г или больше. В высокобелковых матрицах может хватить и 0,15–0,20 г. При использовании «классических» ручных приборов и колб навеску стоит увеличивать раза в два; полуавтоматические аппараты и особенно автоматические титраторы позволяют уменьшать навески без потери воспроизводимости и правильности результатов.

Анализируемые по методу Кьельдаля пищевые жидкости, например молоко, содержат, как правило, меньше белка, поэтому объём образца должен быть в среднем больше — от 1 мл и больше. Принцип расчёта остаётся прежним, однако жидкости могут вести себя сложнее: пениться, сильно разбавлять кислоту и т. д.

Если говорить об экологических образцах, как то сточные воды, то объём образца может достигать 100 мл и требует особого подхода, в том числе использования гораздо бóльших колб.

Также мы уже писали, что не стоит забывать про важность пробоподготовки. Чем мельче будут частицы образца, тем большую удельную поверхность он будет иметь, тем в большем количестве центров будет протекать разложение, тем быстрее пройдёт минерализация.

Количество кислоты

В процессе минерализации кислота расходуются на:

• разложение и окисление органической матрицы (1 г белка расходует в среднем 4,9 мл кислоты, а 1 г жира — 9,7 мл). Соответственно, более жирные образцы требуют большего количества кислоты;
• взаимодействие с катализатором (превращение сульфата в гидросульфат).

1 г K₂SO₄ заберёт примерно 0,3 мл кислоты (то есть 1 таблетка 5 г — 1,5 мл);

• испарение. Какое-то количество кислоты просто улетит в процессе минерализации. Количество зависит от температуры, от эффективности охлаждения и конструкции прибора. Быстрее всего таким способом кислота тратится на первых этапах, когда разложение самое интенсивное, а в колбе наблюдается «туман». Практика показывает, что при начальном объёме кислоты 25 мл в ручном приборе можно потерять около 7 мл на испарение, а в современных дигесторах — до 1,5 мл.

Подытоживая (и очень сильно усредняя), можно прийти к такому соотношению: 0,2–0,7 г образца с относительно высоким содержанием белка, 15–20 мл кислоты, 5–10 г катализатора.

Время разложения

Время разложения в общем виде зависит от целого комплекса факторов:

• тип образца;
• количество соли и собственно катализатора;
• тип катализатора;
• температура процесса;
• наличие окислительных добавок и т. д.

Как правило, время подбирается эмпирически при постановке методики. Возвращаясь к целям минерализации, отметим, что мы должны получить прозрачный раствор по окончании процесса, что косвенно говорит о том, что вся матрица разрушилась, а азот высвободился. Если в колбе ещё наблюдается дым или туман, если на стенках видны чёрные точки, а в растворе плавает осадок, всё это говорит, что времени прошло недостаточно (или режим подобран не оптимально).

Но не стоит спешить даже после того, как раствор стал «чистым», поскольку исследования показывают, что даже после просветления до 5 % азота всё ещё может быть в недоступной для титрования форме. Кривая извлечения медленно выходит на плато, а значит надо ещё какое-то время покипятить раствор.

В большинстве методик 60–90 мин считаются стандартом и позволяют извлечь азот на 99+ %. Использование ручных аппаратов требует большего времени минерализации, а современные дигесторы с ИК-нагревом или добавка окислительных агентов (например пероксида водорода) значительно снижают его.

С другой стороны, стоит помнить, что необоснованно долгое интенсивное кипячение может приводить к потере части азота.

Иные факторы

Некоторые смеси могут активно пениться, что может приводить к невозможности достижения нужной температуры и перекрёстного загрязнения: нельзя допускать попадание пены выше горлышка колбы! В этом случае можно попробовать подобрать другой режим или состав, а эффективнее всего — добавить специальный пеногаситель. В нашем портфолио есть готовое решение в виде силиконового пеногасителя в таблетках.

По мере нагревания смесь долго не кипит, а потом вскипает внезапно или процесс кипения происходит с рывками и толчками. Рекомендуем в этом случае добавить пористые материалы, служащие центрами образования паровой фазы. Подойдут прокалённые и/или промытые в кислоте куски фарфора, корунда или стеклянные шарики, на лабораторном сленге называемые «кипелками» или «кипятильниками».

Холостые и положительные пробы

Не забывайте про необходимость помимо собственно образцов проводить анализ холостых проб (только кислота и катализатор, чтобы исключить присутствие в них азота или внести соответствующую поправку), а также, желательно, положительных проб с заведомо известным содержанием азота (опять же для поправок и калибровки результатов) — в качестве них могут использоваться, например, аминокислоты или сертифицированные образцы. Несоответствие результатов, полученных на положительных пробах, с паспортными данными совершенно точно говорит об ошибке; если воспроизводится — о систематической. В идеале используем стандарт с аналогичной матрицей, в худшем случае — аминокислоту, нагруженную углеводами, но стоит помнить, что степень извлечения в таких простых системах может быть гораздо выше, поскольку они проще и быстрее разлагаются.

Бонус: over-kill режим от KjelReference

Если режим ещё не отработан или результаты нестабильны, производитель НПЦ «Референс» (KjelReference) предлагает готовый стартовый протокол — over-kill: намеренно избыточные время нагрева, объёмы кислоты и щёлочи, двойные навески, обязательные холостые и положительные контроли. Режим не заменяет ваш ГОСТ или ISO, но помогает быстро получить воспроизводимый результат и отделить ошибки оператора от проблем с матрицей.

После стабилизации результатов параметры можно сокращать — в том числе по принципам из этой статьи. Пошаговый протокол с конкретными объёмами реагентов, схемой нагрева и контролем дистилляции:

Универсальный over-kill режим на системе Кьельдаля

Итоги

• Минерализацию оптимизируют в первую очередь: от неё зависят время анализа и полнота извлечения азота.
• Держите температуру в интервале 360–410 °C, соотношение кислоты и катализатора 1,5–2,0 мл на 1 г, плавный разогрев в начале процесса.
• Подбирайте навеску под ожидаемый азот (50–120 мг N), учитывайте жирность матрицы, тип прибора и объём пробы — для сточных вод до 100 мл и даже больше.
• Ориентируйтесь на прозрачный раствор и 60–90 мин кипячения, но не останавливайтесь сразу после просветления.
• Контролируйте пенообразование, при необходимости используйте пеногаситель и кипелки; обязательны холостые и положительные пробы.
• При нестабильных результатах начните с over-kill протокола, затем возвращайтесь к оптимизации режима.